真菌菌絲的總RNA的提取

 真菌菌絲的總RNA的提取

試劑：

RNA 提取緩沖液（CTAB）：2% CTAB（W/V），2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP（W/V），100 mM Tris-HCl（pH8.0,DEPC處理的水配置），25mM EDTA, 0.5g/L 亞精胺Spermidine，2.0M NaCl，2%巰基乙醇（V/V，使用前加入）。由于在高溫滅菌條件下，Tris-HCl要和DEPC發生反應，所以配RNA提取緩沖液時直接用DEPC 處理的水配制即可。

SSTE：1 M NaCl，0.5% SDS（W/V），10 mM Tris-HCl pH8.0，1.0 mM EDTA

10M LiCl 直接用蒸餾水配10M LiCl，加1‰的DEPC過夜后，高溫滅菌。

3M NaAc

氯仿:異戊醇（24:1）

酚（pH4.5）:氯仿:異戊醇（25:24:1）

DEPC處理水 用1‰的DEPC處理蒸餾水過夜，高溫滅菌

無水乙醇

70%酒精

方法

1. 實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱，離心管中加入ME（巰基乙醇）（10mL加80ul，50mL中加入300ul）。

2.取約0.8g菌絲體（液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了），在液氮中迅速磨成精細粉末，裝入50 mL離心管，按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液，顛倒混勻。

3. 65℃水浴3-10 min，期間混勻2-3次

4. 加入等體積的酚（注意是酸酚pH4.5）:氯仿:異戊醇（25:24:1）抽提（10,000 rpm，4℃，5 min）

5. 取上清，等體積的氯仿:異戊醇（24:1）抽提（10,000 rpm，4℃，5 min）

6. 加入1/4V體積10M LiCl溶液，4℃放置6hr以上（或過夜）

7. 10,000 rpm，4℃離心20 min

8. 棄上清，用500 ulSSTE溶解沉淀

9. 酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）抽提兩次，氯仿:異戊醇（24:1）抽提1次（10,000 rpm，4℃，5 min）

10. 加2V體積的無水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30 min以上

11. 12,000 rpm，4℃離心20 min

12. 棄上清。沉淀用70%酒精漂洗一次，干燥

13. 加200 ul的DEPC處理水溶解

14. 用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
      （在抽提過程中，若蛋白質含量或其它的雜質還較多，可以增加抽提次數）
      注意：提取RNA請盡量在低溫下操作，如果條件不容許，在室溫下操作的時間要盡可能的短。

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